·论著·

蝉翼藤单体提取化合物对乙醇诱导小鼠肝脏氧化损伤保护作用研究
李辰,黎莹,李丽,杨成芳,钟毓娟,吴丹,石琳,陈莉,李勇文*
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81360497);广西高等学校优秀中青年骨干教师培养工程项目;2016年自治区级大学生创新创业训练计划项目(201610601046)
541000广西桂林市,桂林医学院
*通信作者:李勇文,教授,主要研究方向:抗炎免疫药理学;E-mail:liyongwen99@163.com

本研究背景:
    随着经济的发展和生活水平的提升,我国饮酒人群也日益增多,酒精性肝病(ALD)发病率逐年上升,对人类健康和社会发展构成了严重威胁。ALD的发病因素单一,即大量乙醇摄入所致,但其发病机制较为复杂,目前尚不十分清楚。近年来,自由基过量产生导致的氧化应激在ALD中的重要作用已成为共识。本研究从抵抗氧化应激角度入手研究蝉翼藤单体提取物——甲基阿魏酸对乙醇诱导的小鼠肝脏氧化损伤保护作用,为将其开发成一种新的解酒保肝药物提供必要的理论依据。

    【摘要】目的探讨蝉翼藤单体提取化合物——甲基阿魏酸对乙醇诱导小鼠肝脏氧化损伤及B淋巴细胞瘤2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)表达的影响,研究甲基阿魏酸的保护作用。方法2017年3—6月,选取SPF级雄性成年C57BL/6小鼠60只,采用随机数字表法分为正常组、模型组和甲基阿魏酸低剂量组(5 mg/kg)、甲基阿魏酸中剂量组(10 mg/kg)、甲基阿魏酸高剂量组(20 mg/kg),每组12只。除正常组以外,其余各组每天早上50%乙醇溶液按照0.1 ml/10 g体质量灌胃。每天下午,甲基阿魏酸给药组分别给予相应剂量的甲基阿魏酸灌胃,连续4周。取肝组织苏木素-伊红(HE)染色,观察其病理改变。计算肝脏指数、脾脏指数,生化分析法测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)及肝组织过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blotting法分别检测肝组织中Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组、甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝脏指数、脾脏指数增加,血清ALT、AST、TC、TG水平升高,肝组织CAT、GSH-Px、SOD水平降低,MDA水平升高,肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2升高(P<0.05);与模型组比较,甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝脏指数、脾脏指数和血清ALT、AST、TC、TG及MDA水平降低,肝组织CAT、GSH-Px、SOD水平升高,肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2降低(P<0.05)。甲基阿魏酸高剂量组小鼠以上指标改善最明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论甲基阿魏酸对乙醇诱导的小鼠肝损伤具有保护作用,可有效改善肝功能,减轻肝损伤程度,维持Bax、Bcl-2的平衡,其机制可能与抵抗肝脏氧化损伤以及抑制细胞凋亡有关。
    【关键词】蝉翼藤属;甲基阿魏酸;乙醇;氧化性应激
    【中图分类号】R 965【文献标识码】ADOI:10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.098
李辰,黎莹,李丽,等.蝉翼藤单体提取化合物对乙醇诱导小鼠肝脏氧化损伤保护作用研究[J].中国全科医学,2017,20(35):4391-4396.[www.chinagp.net]
LI C,LI Y,LI L,et al.Effects of monomeric compound extracted from securidaca on the protection of liver against oxidative damage induced by ethanol in mice[J].Chinese General Practice,2017,20(35):4391-4396.
Effects of Monomeric Compound Extracted from Securidaca on the Protection of Liver Against Oxidative Damage Induced by Ethanol in MiceLI Chen,LI Ying,LI Li,YANG Cheng-fang,ZHONG Yu-juan,WU Dan,SHI Lin,CHEN Li,LI Yong-wen*
Guilin Medical University,Guilin 541000,China
*Corresponding author:LI Yong-wen,Professor,Mainly engaged in anti-inflammatory immunopharmacology research;E-mail:liyongwen99@163.com
    【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of methyl ferulic acid,a monomeric compound extracted from securidaca based on analyzing its effect on the oxidative damage in liver and the expressions of Bax and Bcl-2 in mice induced by ethanol.MethodsFrom March to June 2017,60 SPF grade male C57BL/6 mice were selected and randomized into normal group,model group and low-dose(5 mg/kg) methyl ferulic acid group,middle-dose (10 mg/kg) methyl ferulic acid group,high-dose(20 mg/kg) methyl ferulic acid group,12 in each group.Except the normal group,the other groups were given intragastric administration of 50% ethanol solution in a volume of 0.1 ml/10 g body weight every morning,the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups additionally received intragastric administration of methyl ferulic acid solution in a volume of 5 mg/kg,10 mg/kg,20 mg/kg body weight,respectively every evening,for 4 weeks.Hepatic tissues of the mice were taken out and stained with HE,and their pathological changes were observed.The liver index and splenic index were calculated.Biochemical analyses of serum ALT,AST,TC,TG,catalase (CAT),glutathione peroxidase (GSH-Px),superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde(MDA) levels were performed.The expressions of Bax,Bcl-2 mRNA in liver tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The expressions of Bax and Bcl-2 in liver tissues were detected by western blotting.ResultsIncreased values of liver index,splenic index,ALT,AST,TC,TG and MDA,elevated expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and Bax/Bcl-2,and decreased values of CAT,GSH-Px,SOD were found in the model group,low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups rather than the normal group(P<0.05).The model group had higher values of liver index,splenic index,ALT,AST,TC,TG,MDA,increased expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and Bax/Bcl-2 but lower values of CAT,GSH-Px and SOD than the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups(P<0.05).The values of all the above markers differed significantly between the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups(P<0.05).ConclusionMethyl ferulic acid can protect the liver against oxidative damage induced by ethanol in mice manifested as improving liver function and alleviating the degree of hepatic injury,and stable the expressions of Bax and Bcl-2,which may be related to its resistance to oxidative damage of liver and inhibition of cell apoptosis.
    【Key words】Securidaca;Methyl ferulic acid;Ethanol;Oxidative stress
    乙醇滥用是世界范围内致病率和死亡率居高不下的主要原因之一,肝脏是人体最大的代谢器官,也是乙醇损伤的主要靶器官之一。酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是一个涵盖广泛的医学术语,范围包括从简单脂肪变性到脂肪性肝炎、进行性肝纤维化、肝硬化及肝癌等一系列表型[1]。这些酒精性疾病发生、发展机制尚未完全了解。目前研究发现,除乙醇过量摄入外,遗传因素、营养条件、能量代谢、氧化应激、免疫异常等条件在ALD的发生、发展中发挥关键作用[2]。目前,ALD的治疗措施主要包括戒酒、营养支持和给予皮质类固醇药物,但效果不佳。由于长期过量乙醇摄入导致的ALD已经是一个全球性健康问题,中草药由于可调控多个靶点及不良反应小等特点,在预防和治疗ALD领域引起了广泛关注[3]。甲基阿魏酸是从广西特色中草药蝉翼藤中提取的单体化合物[4],蝉翼藤具有抗炎、增强免疫功能、抗乙型肝炎病毒等活性[5]。本实验采用乙醇诱导小鼠肝脏亚急性损伤模型,着眼于观察甲基阿魏酸对乙醇摄入引起肝损伤的保护作用,为开发解酒保肝产品乃至治疗ALD寻找思路,为进一步深入研究提供科学依据。
1   材料与方法
1.1  药品和试剂   甲基阿魏酸(美国Sigma公司),无水乙醇(AR级,汕头市西陇化工有限公司),丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所),总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕,兔抗B淋巴细胞瘤2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、β-actin抗体、山羊抗兔二抗〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕,DYY-6C型双稳定时电泳仪(北京六一生物科技有限公司),Model 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司),Chemi Doc型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),752型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司),TGL-16B型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂),5424R台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。
1.2  实验动物   2017年3—6月,SPF级雄性成年C57BL/6小鼠60只,体质量18~22 g,由桂林医学院实验动物中心提供〔实验动物使用许可证号:SCXK(桂)2017-0050〕。小鼠饲养于桂林医学院实验动物中心内,房间室温18~24 ℃,湿度60%,12 h照明,12 h黑暗,清洁笼子隔日1次。使用标准维持饲料和蒸馏水,动物自由饮水和进食。
1.3  动物分组和造模方法   将60只小鼠适应性饲养1周后,称体质量。采用随机数字表法分为正常组、模型组和甲基阿魏酸低剂量组(5 mg/kg)、甲基阿魏酸中剂量组(10 mg/kg)、甲基阿魏酸高剂量组(20 mg/kg),每组12只。除正常组以外,其他各组先给予30%乙醇溶液,按照0.1 ml/10 g体质量适应性灌胃,正常组给予相同体积的0.9%氯化钠溶液灌胃,连续3 d。第4天开始,除正常组以外,其余各组每天早上50%乙醇溶液按照0.1 ml/10 g体质量灌胃。每天下午,甲基阿魏酸给药组分别给予相应剂量的甲基阿魏酸灌胃,连续4周。实验期间各组小鼠均给予相同标准的饲料和蒸馏水,并观察记录其一般状况、体质量变化等情况。
1.4  样本收集   末次给药后,禁食不禁水12 h。脱臼法处死前称体质量,取肝脏和脾脏,在滤纸上轻轻拭干后立即称质量,记录肝脏质量和脾脏质量。各组均取肝叶中部用甲醛溶液固定,苏木素-伊红(HE)染色,观察其病理变化。摘眼球采血1~2 ml待检测。
1.5  肝脏指数、脾脏指数及病理变化的检测   肝脏指数(%)=肝脏质量(g)/体质量(g)×100%,脾脏指数(%)=脾脏质量(g)/体质量(g)×100%。电镜下观察各组切片HE染色情况,比较其差异情况。
1.6  生化分析法检测小鼠血清ALT、AST、TC、TG及肝组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平   将全血静置2 h后,以4 000 r/min离心10 min(离心半径4.8 cm),分离血清。按照试剂盒方法测定血清中ALT、AST、TC和TG水平;取小鼠肝脏相同部位组织制备肝组织匀浆,按照试剂盒方法测定小鼠肝组织中CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平。
1.7  反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测肝组织Bax、Bcl-2 mRNA的表达   取各组小鼠肝组织约100 mg,按照总RNA提取试剂盒说明书,采用Trizol法抽提肝组织总RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA含量及纯度,OD260/OD280在1.8~2.0。依据试剂盒说明书,将总RNA反转录成cDNA。查找基因序列并设计引物,以β-actin为内参。Bax引物序列:上游引物:5′-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3′,下游引物:5′-AATTCGCCGGAGACACTCG-3′;Bcl-2引物序列:上游引物:5′-TCAGAGCGAGAAGGTAGGGA-3′,下游引物:5′-CTGTGGGGTAACAAGAAGGTC-3′;β-actin引物序列:上游引物:5′-GGACTCCTATGTGGGTGACGA-3′,下游引物:5′-ACGGTTGGCCTTAGGGTTCA-3′。反应条件:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,45~68 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;最终产物72 ℃,10 min。反应结束后分别取10 μl产物及5 μl DNA marker进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统检测灰度值,Image Lab软件进行分析。
1.8  Western blotting法检测肝组织Bax、Bcl-2的表达   取各组小鼠肝组织约100 mg,剪碎,置于EP管中。加入配好的1 ml RIPA蛋白裂解液〔含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕,用玻璃匀质器匀浆,充分裂解后,冰上静置5 min。冷冻离心,以13 000 r/min离心10 min(离心半径5.6 cm)。取上清液,采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量。10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,用Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育,4 ℃摇床过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶10 000),常温孵育1 h,ECL化学发光法显影,并测定灰度值。
1.9  统计学方法   采用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2   结果
2.1  各组小鼠的一般状况及肝脏指数、脾脏指数测定结果   正常组小鼠状况良好、反应敏锐,无死亡。模型组小鼠经乙醇灌胃先产生兴奋后产生醉意、反应迟钝,部分小鼠腹泻,死亡1只。甲基阿魏酸给药组小鼠精神状态比模型组有所改善,无腹泻,无死亡。
    5组小鼠肝脏指数、脾脏指数比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中,与正常组比较,模型组、甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝脏指数、脾脏指数增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝脏指数、脾脏指数降低,差异均有统计学意义(P<0.05);甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织肝脏指数、脾脏指数两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。
 
2.2  5组小鼠肝脏病理学观察   HE染色结果显示,正常组小鼠肝脏汇管区及肝小叶架构清晰完整,肝索整齐排列,肝细胞无炎症坏死。模型组小鼠肝脏汇管区周围肝细胞肿胀且肝索混乱排列,肝小叶附近肝细胞呈气球样病变,部分肝实质细胞坏死。甲基阿魏酸给药组小鼠肝脏损伤程度有所改善,细胞坏死情况减轻(见图1)。
 
图1甲基阿魏酸对肝损伤小鼠肝组织形态学的影响(HE染色,×200)
Figure 1Effect of methyl ferulic acid on liver histomorphology in 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver
2.3  5组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比较   5组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中,与正常组比较,模型组、甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平两两比较(除甲基阿魏酸低剂量组与甲基阿魏酸中剂量组小鼠血清TC水平),差异均有统计学意义(P<0.05,见表2)。
 
2.4  5组小鼠肝组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比较   5组小鼠肝组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中,与正常组比较,模型组、甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织CAT、GSH-Px、SOD水平降低,MDA水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织CAT、GSH-Px、SOD水平升高,MDA水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平两两比较(除甲基阿魏酸低剂量组与甲基阿魏酸中剂量组小鼠肝组织GSH-Px、MDA水平),差异均有统计学意义(P<0.05,见表3)。
 
2.5  5组小鼠肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2比较   5组小鼠肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中,与正常组比较,模型组、甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2降低,差异均有统计学意义(P<0.05);甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05,见表4、图2、3)。


3   讨论
    ALD是由于乙醇在体内代谢异常导致的肝脏代谢紊乱性疾病,乙醇可以作为毒物直接作用于肝脏导致损伤。本研究采用乙醇灌胃法建立肝损伤模型,不仅符合人类饮酒习惯,而且死亡率低于乙醇腹腔注射法。大量摄入的乙醇经乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶氧化后,最终催化产物是乙醛,乙醛对机体有直接损伤作用。乙醇诱导微粒体乙醇氧化系统,增加了肝脏能量的消耗,造成肝内能量耗竭,引起肝细胞损伤[6]。
    乙醇对机体造成的损伤作用涉及多种病理机制,越来越多的研究认为ALD作为复杂的病理过程,涉及氧化应激、炎症和过多脂肪酸合成[7]。氧化应激是ALD发生、发展的重要机制之一,其可被定义为体内氧自由基稳态水平的量度生物系统。长期乙醇摄入会消耗抗氧化防御系统的一些重要酶系,比如CAT、GSH-Px、SOD,还会促进活性氧(ROS)和活性氮物质(RNS)的形成,这些物质会损伤DNA、蛋白质和脂质。乙醇及其代谢物使氧化应激处于持续状态,这是ALD的重要生化表现之一[8]。本研究结果显示,甲基阿魏酸可显著提高CAT、GSH-Px及SOD水平,维持体内氧化还原平衡状态。MDA是脂质过氧化的终产物,有细胞毒性,是客观反映机体自由基水平的可靠指标[9],本研究结果显示,甲基阿魏酸可显著降低MDA水平,可抵抗组织脂质过氧化损伤。
    乙醇可导致脂肪代谢紊乱,从而损害肝脏[10]。脂肪代谢紊乱是ALD最早出现的病理状况。本研究发现,模型组大鼠肝脏指数增大,血清TC、TG水平升高,表明肝脏中脂肪集聚。而给予甲基阿魏酸灌胃能显著抑制肝脏指数增大,降低血清TC、TG水平,表明甲基阿魏酸能够有效调节肝脏中脂肪代谢紊乱。
    前期研究发现甲基阿魏酸对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用[11]。本研究发现,甲基阿魏酸可降低血清中ALT、AST水平,具有保肝作用。与模型组相比,甲基阿魏酸还可降低脾脏指数,具有抗炎免疫作用。
    Bcl-2是细胞凋亡研究中引人注目的关键基因之一,Bax是Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因,Bax过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而导致细胞凋亡[12]。Bcl-2主要位于细胞核、线粒体以及内质网膜中,但以Bax为代表的促进凋亡的家族主要位于细胞质中,Bax含有BH1、BH2和BH3结构域,并可启动凋亡信号[13]。作为抑制细胞凋亡蛋白家族的两种典型蛋白,Bcl-2和Bax在调节线粒体的膜透性方面起着关键作用。当凋亡信号刺激时,Bax转运到线粒体,使线粒体膜电位降低,直接或间接增强线粒体膜的通透性。Bcl-2可以稳定线粒体膜的屏障功能,并抑制细胞凋亡诱导因子向细胞核转移[14]。本研究结果显示,与模型组比较,甲基阿魏酸低、中、高剂量组小鼠肝组织Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白降低,甲基阿魏酸可上调Bcl-2表达,并抑制Bax表达,具有抑制细胞凋亡的作用。
    综上所述,在本实验剂量范围内,甲基阿魏酸对乙醇诱导的小鼠亚急性肝损伤具有保护作用,且药效与剂量呈梯度依赖关系。这种保护作用机制可能与抵抗肝脏氧化损伤以及抑制细胞凋亡有关。本研究不足之处是没有对甲基阿魏酸抗ALD靶点蛋白进行研究。鉴于人们长期酗酒的习惯[15],今后将在乙醇诱导的慢性肝损伤模型上进一步验证甲基阿魏酸的解酒保肝作用。
    作者贡献:李辰、李丽进行文章的构思与设计,对文章整体负责,监督管理;李辰、黎莹、吴丹、石琳、陈莉进行研究的实施与可行性分析;李辰进行数据收集,统计学处理,撰写论文;李辰、杨成芳进行数据整理;李辰、钟毓娟进行结果的分析与解释;李勇文负责文章的质量控制及审校。
    本文无利益冲突。
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(收稿日期:2017-07-18;修回日期:2017-09-07)
(本文编辑:陈素芳)